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    SA-β-gal的檢測方法,你了解多少?

    更新時間:2021-09-16   點擊次數:8160次
      生衰退的變化過程。細胞衰老時,衰老相關半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性會顯著增加,故常常檢測衰老相關半乳糖苷酶的活性以區分正常細胞與衰老細胞。目前,不同條件或化合物作用細胞后,常常用衰老相關半乳糖苷酶檢測作為細胞衰老的標志之一。
     
      SA-β-gal檢測方法主要分為細胞化學染色法和熒光法。
     
      一、細胞化學染色法:SA-βgal在pH6.0時,可將5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷水解,產生不溶于水的藍色物質。這種藍色產物相當穩定,固定干燥后避光可保存幾個月。通過計算總群體中藍色細胞的數量,可以很容易地確定SA-β-半乳糖苷酶陽性的細胞比例,即衰老細胞的比例。但是需要注意的是,在所有細胞中普遍存在酸性半乳糖苷酶,在pH4.0時發揮作用。其實SA-βgal發揮作用的最適pH為4.5,但是在pH4.5時,酸性半乳糖苷酶也會水解底物,因此需要使用SA-βgal次適pH6.0,才能確保藍色產物是由于SA-βgal的作用而產生的。通常我們使用pH為6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。
     
      二、熒光法:熒光法需要借助另一種底物——C12FDG,不具有熒光,能透過細胞膜,但被βgal水解后可產生綠色熒光產物。利用流式細胞儀可檢測綠色熒光的產生,藉此反映βgal的表達。因此要想檢測SA-βgal的活性,需要先將溶酶體堿化至pH6.0。這一過程可使用氯喹或巴弗洛霉素A1等,可降低溶酶體的酸度,使溶酶體堿化至pH6.0。然后向細胞中加入C12FDG,孵育后制成可供流式分析細胞懸液,即可利用FC500MPL流式細胞儀等檢測SA-βgal的表達。
     
      SA-β-gal細胞化學染色法通常需要半小時染色,數小時甚至一天時間等待染色完成以觀察和計數,而熒光法需要4至8小時處理細胞,1天內可完成計數。前者不僅可用于細胞培養液還可用以組織切片的染色,而且所需試劑和設備簡單,而后者更為高效,靈敏,定量更為準確。因此,根據實驗的不同目的可選擇不同的檢測方法。




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